ngs在病原微生物检测中的应用
背景相关
由病原微生物引起的感染性疾病是临床面临的最常见的疾病之一，并且随着人群结构变化、环境污染以及药物滥用等因素的影响，病原体呈现多样化和复杂化的趋势，逐步威胁人类健康。 随着测序技术的飞速发展，ngs已逐步应用于感染性疾病的诊断、治疗和监测，在病原微生物鉴定、分型、耐药突变检测及新型病原体鉴定方面有其独特的优势。
病原微生物检测现状
快速准确的诊断可以对病情进行监控，提供有效治疗，控制疾病的蔓延。目前常用的病原微生物分子检测方法主要有：pcr技术（包括常规pcr以及qpcr），基因芯片技术，ngs测序技术。还有一些其他技术如质谱（maldi-tof-ms）等。
方法
优点
局限
pcr技术
灵敏度与特异性高，实现快速鉴定
须有潜在的目标病原菌，从而针对性检测
基因芯片
成本低，同时结合微机械技术，将样本预处理核酸提取，扩增以及杂交后的检测集成为一张芯片。
只能对于已知的病原体进行意向性筛查，无法检测新的未知病原体
ngs
不依赖于已的核酸序列，不需额外设计探针.针对难以培养甚至无法分离培养的菌属有显著优势。
拼接组装的难点
质谱技术
有效缩短了检测周期，且操作相对简便。且更能检测到活跃状态的病原微生物
只能检测已有蛋白谱的微生物
ngs在病原微生物检测的中的应用
1、感染性疾病病原体的鉴定
传统的检测方法主要有涂片镜检，生化反应和免疫学检测等等，但存在周期长、过程复杂以及灵敏度低等特点。pcr技术的出现部分解决了上述的问题，但是难以解决未知微生物检测的难题。而ngs检测无需对病原体进行分离培养，也不依赖于已知的核酸序列设计引物等，可直接对标本进行测序鉴别，大大缩减建库时间，提高诊断效率，尤其在未知病原微生物检测方面有无与伦比的优势。
检测方法
时长
特点
通量
涂片镜检
数分钟~数小时
快速检查，无法精确判断，主要作为初诊手段。
低通量，单次检测一种/类微生物
生化反应
数小时~数天
针对特定微生物检测
免疫学检测
ngs
1-3天
时间短，所有病原体一次检出
高通量，单次检出所有微生物
目前ngs在病原微生物鉴定方面主要有两种形式：rrna多样性测序和全基因组测序，前者偏向细菌、真菌的鉴定以及菌群分析，后者获取的信息更为全面，一般偏重病毒鉴定。
2、病原体耐药及毒力特征检测
在当前的抗生素不规范使用以及宿主免疫等重重压力下，病原体势必在毒性以及耐药方面有进化。这种高毒性的以及高耐药性的菌株往往是导致感染性疾病发病率、死亡率居高不下的重要原因。
临床上耐药性及毒性检测方法主要是体外药物敏感性试验、耐药菌表型检测等方法。这些方法操作繁琐，且较费时、费力。ngs技术通量高、快速，在一次测序反应中即可获得细菌整个基因组的耐药、毒力等相关基因信息，有助于揭示病原体毒力及耐药机制，对临床治疗及指导用药均具有重要意义。
3、病原体分型及流行溯源
目前病原体分型方法主要有多位点序列分型、脉冲场凝胶电泳、多位点串联重复序列分析技术等。这些技术可检测病原体的型别，但分辨率较低，对于相似或变异度极高的病原体如病毒等则难以区别。而 ngs则弥补了此项缺陷，通过检测病原体全基因组序列，获得全部遗传信息，被认为是分辨率zui高的病原体分型方法。
病原体分型技术
优势
局限性
多位点序列分型（mlst）
操作简单，应用方便，可重复性强，易实现标准化，不同实验室结果可比性高
分辨力较低，价格高昂
脉冲场凝胶电泳（pfge）
分辨率较高，可重复性强
操作繁琐，周期较长，设备昂贵，实验室间可比性较差
多位点串联重复序列分析（mlva）
分辨力较高，成本低，操作简易
引物设计繁琐，实验室间可比性较差实验室间可比性较差，计算结果准确性不高
ngs（主要是wgs）
分辨力极高
工作量大，周期长，价格高昂
近年来抗生素的不规范使用甚至滥用，使细菌耐药情况日益突出，耐药菌株在医院内的暴发时有发生。ngs技术在对耐药菌等病原体进行分型的基础上，可以判断同源性远近，分辨不同的进化路线，成为追踪病原体不可或缺的重要手段。
4. 肠道微生物菌群宏基因组测序分析
宏基因组学（metagenomics）：以微生物生态群落中所有微生物的基因组为研究对象，通过直接从环境样本中提取全部微生物的dna或者rna构建宏基因组文库，研究群落中物种组成和功能组成、同一个群体内不同微生物的相互作用、微生物群落与宿主之间的相互作用，并进行不同表型的样品比较分析，来解释生物学现象。
图来源于fields，science. 2001,291,5507:1221-1224
近年来肠道微生物相关研究愈趋火热，不少研究表明，肠道菌群与宿主共生共进化，在营养代谢等方面影响人体健康，肠道微生态失衡与人体诸多疾病存在密切关系。肠道微生物中关键功能菌更是有可能成为疾病诊治的新型生物标志物和治疗靶点。2015年《科学》杂志还发文呼吁发起“联合微生物组计划”。而ngs测序有望凭借其数据通量高、成本低、速度快的特点，成为研究肠道微生物和宏基因组学的有力工具。
ngs在应用中面临的主要挑战
虽然ngs在病原微生物的检测中有着明显的优势，但是也依然面临不少挑战：
参考数据库的完整性微生物检测鉴定的准确性很大程度上取决于参考数据库的范围与完整性；
临床标本的复杂性临床标本来源复杂多样，可能存在病原体信息太少而导致数据丢失或病原体数据混杂在正常菌群中难以区分;
ngs测序技术的局限性目前的分析质量依赖于测序质量、基因组组装的质量以及参考基因组序列的选择和质量；
质量控制和标准化参考基因组的选择，分型方法如何选择等，目前尚未建立不同标本测序前处理和参数设置的统一标准。
文末小结：
ngs技术被认为是一种极具应用前景的实验技术，尽管依然路途艰辛，但随着测序成本的降低以及测序技术的进步，相比较于其他的检测方法，ngs在病原微生物检测行业的优势逐渐凸显，必将成为临床诊断的有力工具。目前国内的基因检测市场空间巨大，临床医师也越来越认识到这项技术的价值，加上目前初始阶段的从业者们在参考数据库构建等方面的持续耕耘，病原微生物基因检测市场有更广阔的空间亟待发掘。
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96 t
参考文献：
1.分子技术在感染性疾病病原体溯源和监测中的应用与展望, 中华医学检验杂志. 2018，41（1）：1-4
2.新一代测序技术在临床微生物检测中的应用, 诊断学理论与实践. 2018，2：127-131
3.宏基因组测序在感染性疾病病原体检测中的应用, 传染病信息. 2018，1（31）：15-18
4.感染性疾病病原学诊断新技术与临床应用策略, 协和医学杂志. 2018，9（5）：399-403
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